Исследования

Какая часть протеома доступна для анализа современными методами?

В 2018 году были продолжены работы российского Консорциума в рамках международного проекта «Протеом человека». В Проекте принимают участие более двадцати стран, объединивших усилия для создания протеомной карты человека.

Сотрудниками НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича предложен оптимальный протокол проведения протеомного анализа, позволяющий зарегистрировать и измерить максимальное количество белков. Протоколом предусмотрены следующие этапы: проведение фракционирования образца методом щелочной обратно-фазовой хроматографии, панорамный масс-спектрометрический анализ и направленное измерение белков масс-спектрометрическим методом мониторинга множественных реакций с использованием изотопно-меченных пептидов в качестве стандарта. Предположительно, использование этого протокола позволит измерить до 80% мастерных белков, присутствующих в биологическом образце.

Полученные результаты могут быть использованы для поиска биомаркеров, создания систем для диагностики ранних стадий социально значимых заболеваний и создания протеомного цифрового образа человека.

Статья: Increased Sensitivity of Mass-spectrometry by alkaline 2D-LC: It is Way to Deep Cover of Human Proteome in Gene-centric Mode Ekaterina V. Ilgisonis, Arthur T. Kopylov, Elena A. Ponomarenko, Ekaterina V. Poverennaya, Olga V. Tikhonova, Tatiana E. Farafonova, Svetlana Novikova, Andrey V. Lisitsa, Victor G. Zgoda and Alexander I. Archakov
(опубликована в ноябре в специальном выпуске журнала Journal of Proteome research, посвященный отчетам по международному проекту «Протеом человека»)

Электрохимия амилоида-бета

Работа выполнена в сотрудничестве с Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и посвящена электрохимическим свойствам пептида амилоид-бета (Aβ). Согласно гипотезе «амилоидного каскада», переход Aβ из мономерного состояния в нерастворимые фибриллярные агрегаты, образующие амилоидные бляшки, является одним из ключевых процессов возникновения болезни Альцгеймера. Вопросы о причинах и механизмах развития данного нейродегенеративного заболевания, а также об эффективных лекарственных средствах для его лечения до сих пор остаются открытыми. Знание электрохимических свойств Aβ и его мутантных форм имеет важное значение для разработки методов анализа влияния различных факторов на поведение пептида in vitro, прежде всего, на его комплексообразование с ионами металлов и агрегацию.

В опубликованных статьях показано электрохимическое окисление амилоида-бета и нескольких его мутантных форм, содержащих аминокислотные замены и посттрансляционные модификации, за счет электроактивных групп остатков тирозина (Тир-10), гистидина (Гис-6, Гис-13 и Гис-14) и метионина (Мет-35) на печатных графитовых электродах. Электрохимический анализ проводили методами циклической и квадратно-волновой вольтамперометрии в области потенциалов от 0 до 1.5 В (отн. Ag/AgCl).

Данная работа расширяет представления об электрохимической активности пептида, поскольку ранее окисление остатков Гис и Мет Aβ известно не было. Тем не менее, остатки Гис представляют интерес для изучения взаимодействия Aβ с ионами металлов, так как напрямую вовлечены в образование комплексов, а регистрация сигнала окисления остатков Мет может быть полезна при изучении кинетики агрегации пептида. Проведенный электрохимический анализ позволил различить некоторые пептиды между собой и отличить их от «нормального» варианта Aβ. В будущем найденные закономерности могут быть применены при изучении других пептидов и белков. В работе было не только подтверждено соответствие регистрируемых сигналов определенным аминокислотным остаткам, но и заложены основы способа идентификации пептидов. Регистрация вольтамперограмм в нескольких заданных областях потенциалов окисления позволяет отнести неизвестный образец к тому или иному пептиду, зная его аминокислотную последовательность. В будущем предложенный подход может быть расширен созданием баз данных вольтамперограмм пептидов различной длины, содержащих как электроактивные, так нейтральные аминокислотные остатки.

НОВЫЙ ДИСТАНТНЫЙ МЕХАНИЗМ ПОДАВЛЕНИЯ АУТОИММУНИТЕТА

На сегодняшний день учеными хорошо изучены контактные механизмы супрессии эффекторных лимфоцитов регуляторными Т-клетками. Однако дистантные (бесконтактные) механизмы регуляции иммунных клеток изучены недостаточно.

       Коллектив сотрудников лаборатории медицинской биотехнологии «НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» открыл новый, ранее неизвестный дистантный механизм регуляции аутоиммунитета, основанный на физиологическом старении иммунных клеток и запуске процессов их самоуничтожения.

«В ходе эксперимента мы содержали в одном культуральном флаконе эффекторные аутоиммунные лимфоциты и регуляторные Т-клетки, которые были отделены специальной мембраной, – рассказывает Дмитрий Дмитриевич Жданов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии. Выяснилось, что в эффекторных лимфоцитах происходит альтернативный сплайсинг РНК каталитической субъединицы теломеразы, которая поддерживает пролиферацию этих лимфоцитов. В результате индуцирования альтернативного сплайсинга теломераза становится неактивной, что естественно приводит к процессу апоптоза клеток. Мы обнаружили это как при исследовании клеток человека, так и при изучении клеток мышей (причем в данном случае как in vitro, так и in vivo).

Понимание такого фундаментального механизма может быть полезно при разработке препаратов для лечения аутоиммунных заболеваний и предотвращения отторжения пересаженных органов и тканей».

  • Zhdanov D.D., Gladilina Y.A., Pokrovsky V.S., Grishin D.V., Grachev V.A., Orlova V.S., Pokrovskaya M.V., Alexandrova S.S., Sokolov N.N. “Murine regulatory T cells induce death of effector T, B, and NK lymphocytes through a contact-independent mechanism involving telomerase suppression and telomere-associated senescence”, Cell. Immunol. (2018), 146 – 160
  • Zhdanov D.D., Gladilina Y.A., Grishin D.V., Grachev V.A., Orlova V.S., Pokrovskaya M.V., Alexandrova S.S., Pokrovsky V.S., Sokolov N.N. “Contact-independent suppressive activity of regulatory T cells is associated with telomerase inhibition, telomere shortening and target lymphocyte apoptosis” Mol. Immunol. (2018), 101, P. 229 – 244

Механизм злокачественной трансформации лимфоцитов человека

Фотография хода эксперимента. Пластиковый планшет со средой для роста клеток.

В настоящее время механизмы злокачественной трансформации нормальных клеток (канцерогенеза) и развития опухолей человека являются предметом особого внимания молекулярных биологов во всем мире. Согласно современным представлениям, нормальная клетка превращается в опухолевую в результате мутаций, при нарушении регуляции генной активности, или же по причине привнесения в ее генетический материал новой генетической информации онкогенными вирусами.

Коллектив лаборатории медицинской биотехнологии «НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» показал, что в основе злокачественной трансформации Т-лимфоцитов, основных клеток иммунной системы человека, лежит взаимодействие двух белков. Первый белок, а скорее белковый комплекс, — это теломераза. Второй белок — эндонуклеаза EndoG. Эти два белка в норме присутствуют в Т-лимфоцитах и необходимы для их нормального функционирования.

«Из крови четырех здоровых доноров мы выделили Т-лимфоциты, внедрили в них ген EndoG для усиленного синтеза данного белка, и культивировали такие клетки в условиях ex vivo в течение длительного времени – комментирует Дмитрий Дмитриевич Жданов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии. Выяснилось, что усиленный синтез EndoG вызывал индукцию альтернативного сплайсинга и образование мРНК неактивной формы hTERT. Следовательно, теломераза в таких Т-лимфоцитах была не активна. Длительное культивирование Т-лимфоцитов с неактивной теломеразой вызывало укорочение теломер до критических значений. Через 20 дней деление клеток прекратилось. А через 32 дня подавляющее большинство клеток погибло путем апоптоза. Единичные клетки оставались живыми еще в течение 30 дней, после чего мы наблюдали лавинообразное деление выживших клеток. Такая скорость деления характерна для многих опухолевых клеток – поясняет Дмитрий Дмитриевич. Мы предположили, что за этот период Т-лимфоциты претерпели злокачественную трансформацию, то есть стали раковыми. Исследование опухолевых молекулярных маркеров показало, что трансформированные Т-лимфоциты имеют признаки клеток злокачественных лимфом. Следующим этапом исследования стало исследование трансформированных клеток на экспериментальных животных. Данные клетки оказались способными образовывать опухоли и вызывали гибель мышей, что однозначно указывает на злокачественные свойства данных клеток».

Явление злокачественной трансформации клеток при укорочении теломер до критического уровня было описано зарубежными коллегами в конце прошлого века. Однако ключевое значение белка EndoG в регуляции этого процесса становится понятно только теперь. Точный молекулярный механизм индукции альтернативного сплайсинга мРНК hTERT и ингибирования активности теломеразы предстоит изучить в будущем. Очевидно, данный процесс является фундаментальным в поддержании клеточных функции и определяет судьбу клеток.

  • Zhdanov D.D., Vasina D.A., Grachev V.A., Orlova E.V., Orlova V.S., Pokrovskaya M.V., Alexandrova S.S., Sokolov N.N. “Alternative splicing of telomerase catalytic subunit hTERT generated by apoptotic endonuclease EndoG induces human CD4+ T cell death”, Eur. J. Cell Biol. 96 (2017) 653 — 664
  • Vasina DA, Zhdanov DD, Orlova E V., Orlova VS, Pokrovskaya M V., Aleksandrova SS et al. Apoptotic endonuclease EndoG inhibits telomerase activity and induces malignant transformation of human CD4+ T cells. Biochemistry (Moscow) 2017; 82: 24–37.

ADVERPred – веб-сервис для предсказания неблагоприятных эффектов лекарств

Нежелательные последствия применения лекарственных средств являются одной из лидирующих причин смертности пациентов, прекращения разработки лекарств-кандидатов на поздних стадиях клинических испытаний, а также отзывов препаратов с рынка. Учитывая сложившуюся ситуацию, необходима разработка дополнительных методов выявления побочных действий выпускаемых лекарств.

Сотрудниками лаборатории структурно-функционального конструирования лекарств ИБМХ был создан веб-сервис ADVERPred для предсказания нежелательных эффектов фармакологических соединений по их структурной формуле. Этот сервис основан на построении зависимостей «структура-активность», связывающих известные побочные действия препаратов с особенностями их структурных формул, и позволяющими делать прогноз для новых соединений. ADVERPred дает возможность предсказывать наиболее серьезные с точки зрения последствий для здоровья пациентов эффекты: инфаркт миокарда, желудочковая тахикардия, сердечная недостаточность, тяжелые поражения печени и почек. Поскольку для прогноза требуется только структурная формула соединения, данный подход может использоваться на самых ранних этапах разработки новых лекарств.

Статья по ADVERPred была опубликована в 2018 году в Journal of Chemical Information and Modeling:
(Ivanov S.M., Lagunin A.A., Rudik A.V., Filimonov D.A., Poroikov V.V. (2018). ADVERPred – web service for prediction of adverse effects of drugs. Journal of Chemical Information and Modeling, 58 (1), 8-11. DOI: 10.1021/acs.jcim.7b00568)

В 2016 году в журнале International Journal of Analytical Chemistry издательства Hindawi Publishing Corporation была опубликована статья коллектива авторов ИБМХ на тему «The Size of the Human Proteome: The Width and Depth» (см. полный текст статьи). Несмотря на скромный импакт-фактор журнала (1.4), данная работа была процитирована авторами статей в Nature (Aebersold et al., NCB, 14, 206–214 (2018) и Science (Bamberger et al., Science Advances, 4-2, 2018)).

В работе описывается, что, вследствие динамичной природы, отличающей протеом от генома, протеом биологических объектов характеризуется многообразием протеоформ и количеством копий каждой протеоформы. Возможности современных аналитических методов не позволяют экспериментально оценить размеры протеома, то есть обнаружить все протеоформы и измерить их содержание в конкретном образце. Для оценки многообразия протеоформ в работе предложена расчетная формула, учитывающая частоты возникновения сплайс-вариантов мРНК, одноаминокислотных полиморфизмов и посттрансляционных модификаций. Проведенный в работе анализ свидетельствует о том, что следует различать протеом (а) конкретного образца – индивидуальный протеом, специфичный для индивидуума и типа биологического материала; (б) биологического материала – объединение индивидуальных протеомов, измеренных в одном и том же типе биоматериала в различных экспериментах; (в) вида организма – популяционный протеом, совокупность сведений об индивидуальных протеомах популяции, объединенных для различных типов биологического материала в составе постгеномных информационных ресурсов.

Проведенная работа позволяет сформулировать новую научную задачу в области постгеномной аналитической биохимии — создание протеомного профиля человека с учетом индивидуальных особенностей экспрессии определенных видов белков (протеоформ).

PPLine: автоматизированный анализ данных секвенирования транскриптома и экзома в контексте протеомики

Сотрудниками ИБМХ был разработан автоматизированный конвейер для обработки данных высокопроизводительного секвенирования транскриптома (RNA-Seq) и экзома (WES) PPLine, позволяющий проводить:

  • 1. Контроль качества исходных данных и их первичную подготовку к обработке (Trimmomatic)
  • 2. Картирование ридов на геном и транскриптом с поиском новых сплайс-границ (Tophat)
  • 3. Поиск мутаций в геноме (SNP) и аминокислотных вариаций в белках (SAP), включая вставки и делеции (samtools/bcftools/GATK)
  • 4. Аннотацию мутаций по базам данных dbSNP, 1000 геномов, Exome Sequencing Project, COSMIC и др. (Annovar), а также оценку их значимости по отношению к функции белка различными алгоритмами (Polyphen, SIFT, LRT и др.)
  • 5. Поиск новых сплайс-форм транскриптов и кодируемых ими белков
  • 6. Создание белковой базы для использования в различных средствах анализа масс-спектрометрических данных (Mascot, MaxQuant, X!Tandem и др.)
  • 7. Идентификацию протеотипических пептидов, специфичных к SAP, к определённому набору сплайс-форм, к новым сплайс-формам

PPLine успешно применяется для анализа транскриптомных и экзомных данных для различных тканей человека, других организмов и модельных объектов.

Статья по PPLine опубликована в специальном выпуске Journal of Proteome Research, посвященном реализации международного проекта «Протеом человека»
(Krasnov G.S., Dmitriev A.A., Kudryavtseva A.V., Shargunov A.V., Karpov D.S., Uroshlev L.A., Melnikova N.V., Blinov V.M., Poverennaya E.V., Archakov A.I., Lisitsa A.V., Ponomarenko E.A. PPLine: An Automated Pipeline for SNP, SAP, and Splice Variant Detection in the Context of Proteogenomics. Journal of Proteome Research, 2015, 14(9), 3729-3737) doi:10.1021/acs.jproteome.5b00490

Комбинация виртуального и экспериментального двумерного электрофореза (2DE) с масс-спектрометрией высокого разрешения

В 2015 году сотрудниками ИБМХ предложен новый способ выполнения пробоподготовки, при котором фракционирование образца выполняется с использованием двумерного электрофореза. С помощью двумерного электрофореза (2DE) высокого разрешения и высокоэффективной масс-спектрометрии (nano-LC-ESI-MS/MS) было идентифицировано более 1500 протеоформ (белковых видов) в клетках клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) и крови человека. Были определены физико-химические (изоточка/молекулярный вес, рI/Mw) параметры найденных протеоформ.

Naryzhny SN, Zgoda VG, Maynskova MA, Novikova SE, Ronzhina NL, Vakhrushev IV, Khryapova EV, Lisitsa AV, Tikhonova OV, Ponomarenko EA, Archakov AI. A combination of virtual and experimental 2DE together with ESI LC-MS/MS gives a clearer view about proteomes of human cells and plasma. Electrophoresis. 2015 Oct 10. doi: 10.1002/elps.201500382

Обнаружен артефакт, препятствующий поиску раковых мутаций в протеоме

Протеогеномика имеет большое значение для раковых исследований благодаря возможности анализа протеомов против модифицированных баз данных, содержащих аминокислотные замены. В ходе данной работы обнаружено явление замены метионина на изотреонин, возникающее при пробоподготовке. Показано, что такая замена не закодирована в геноме. Данный артефакт способен имитировать мутацию и должен быть принят во внимание при раковых исследованиях.

Проведены начальные исследования отличий тандемных спектров пептидов, содержащих треонин и изотреонин, что позволит выявлять модифицированные пептиды в масштабе протеома.

Chernobrovkin AL, Kopylov AT, Zgoda VG, Moysa AA, Pyatnitskiy MA, Kuznetsova KG, Ilina IY, Karpova MA, Karpov DS, Veselovsky AV, Ivanov MV, Gorshkov MV, Archakov AI, Moshkovskii SA. Methionine to isothreonine conversion as a source of false discovery identifications of genetically encoded variants in proteogenomics. J Proteomics. 2015 Apr 29;120:169-78. doi: 10.1016/j.jprot.2015.03.003

Детекция биомаркера гепатита С в сыворотке крови

Предложен метод для обнаружения и идентификации HCVcoreAg-содержащих частиц в сыворотке крови с учетом взаимодействий протеотипических пептидов с ионами Na+, K+, Cl–. В основе данного метода лежит комбинация обратимого биоспецифического АСМ-фишинга, позволяющего концентрировать, выявлять и подсчитывать белковые комплексы на поверхности АСМ-чипа, и метода МС-идентификации визуализированных комплексов.

Ivanov YD, Kaysheva AL, Frantsuzov PA, Pleshakova TO, Krohin NV, Izotov AA, Shumov ID, Uchaikin VF, Konev VA, Ziborov VS, Archakov AI. Detection of hepatitis C virus core protein in serum by atomic force microscopy combined with mass spectrometry. Int J Nanomedicine. 2015 Feb 25;10:1597-608. doi: 10.2147/IJN.S717

Компьютерная оценка механизмов побочного действия лекарств

Используя компьютерную оценку механизмов побочного действия лекарств, выявлены молекулярные мишени лекарственных средств, связанные с индукцией инфаркта миокарда и желудочковых аритмий. Установлены ключевые сигнальные пути, а также процессы на уровне клетки, ткани, органа и организма, нарушение которых под действием лекарств потенциально способно приводить к индукции инфаркта миокарда и желудочковых аритмий; показано, что связь многих из идентифицированных белков, путей и процессов с индукцией инфаркта миокарда и желудочковых аритмий является нетривиальной.

1. Ivanov S.M., Lagunin A.A., Poroikov V.V. (2015) In silico assessment of adverse drug reactions and associated mechanisms. doi: 10.1016/j.drudis.2015.07.018.

2. Ivanov S.M., Lagunin A.A., Pogodin P.V., Filimonov D.A., Poroikov V.V. (2015) Identification of drug targets related to the induction of ventricular tachyarrhythmia through systems chemical biology approach. Toxicological Sciences, 145 (2), 321-336. doi:10.1093/toxsci/kfv054

3. Ivanov S.M., Lagunin A.A., Pogodin P.V., Filimonov D.A., and Poroikov V.V. (2014) Identification of drug-induced myocardial infarction-related protein targets through the prediction of drug-target interactions and analysis of biological processes. Chemical Research in Toxicology, 27 (7), 1263-1281. doi:10.1021/tx500147d

Заявки на патенты:

  • Заявка на патент РФ № 2015111690 подана 01.04.2015. «Электрохимический способ экспресс-анализа комплексообразования амилоида-бета с ионами металлов / Супрун Е.В., Хмелева С.А., Киселева Я.Ю., Радько С.П., Арчаков А.И., Шумянцева В.В.; заявитель и патентообладатель ИБМХ (RU).
  • Заявка на патент РФ на изобретение № 2015111223 от 30.03.2015 г. Производные прегн-17(20)-ена, проявляющие противоопухолевую активность/ А.Ю.Мишарин, С.В. Стулов, Д.К. Шишова, А.В. Веселовский, В.В Шумянцева, А.В. Кузиков, О.М. Ипатова, А.В. Лисица, А.И. Арчаков; заявитель и патентообладатель ФГБНУ «ИБМХ» (RU).
  • Заявка на патент РФ на изобретение №2015155068 от 23.12.2015. Ацильное производное аминофенола, как активатор моноаминоксидазы типа A. /Москвитина Т.А., Тимошенко О.С., Гуреева Т.А.
  • Заявка на зарубежный патент US №0341999 А1 ANTITUBERCULAR COMPOSITION AND METHOD FOR PRODUCING SAME. Ipatova O.M., Medvedeva N.V., Prozorovskiy V.N., Sanzhakov M.A., Tikhonova Ye.G., Druzhilovskaya O.S.


V.V. Shumyantseva,
E.V. Suprun,
T.V. Bulko,
Ya. M. Chalenko
and A.I. Archakov.


Nanomedicine in Diagnostics, Ed. N. Rozlosnik. Part 4. Electrochemical Sensor
Systems for Medicine. p. 68-95.
Publication Date: March 20, 2012 ISBN-10:
1578087384 |ISBN-13: 978-1578087389 Edition: 1

Программа «Протеом человека»

Программа на 2012-2020 гг.


Программа исследований

ПРОГРАММА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ на 2013-2017 годы.


Гранты РФФИ

Текущие работы по проектам, поддержанным ранее Рос­сий­ским фон­дом фун­да­мен­таль­ных ис­сле­до­ва­ний


Гранты РНФ

Текущие работы по проектам, поддержанным РНФ


Международное сотрудничество

Международные на­уч­ные свя­зи ин­сти­ту­та осу­щест­вля­ют­ся по сле­ду­ю­щим ос­нов­ным на­прав­ле­ни­ям